Come i test molecolari stanno trasformando la diagnosi e il trattamento dei tumori cerebrali

Indice

• Introduzione: Perché i test molecolari sono importanti per i tumori cerebrali
• Principali test molecolari per la diagnosi e il trattamento dei tumori cerebrali
• Profilazione della metilazione del DNA: uno strumento diagnostico rivoluzionario
• Sequenziamento del DNA e dell'RNA: rilevamento di mutazioni critiche
• Ulteriori strumenti e tecniche diagnostiche
• Applicazione dei test molecolari alla diagnosi dei tumori cerebrali
• Glioma diffuso dell'adulto: come i test molecolari guidano la diagnosi
• Implicazioni cliniche per i pazienti
• Comprensione dei limiti dei test molecolari
• Raccomandazioni per i pazienti con diagnosi di tumore cerebrale
• Informazioni sulla fonte

Introduzione: Perché i test molecolari sono importanti per i tumori cerebrali

La caratterizzazione molecolare ha completamente trasformato il modo in cui i medici diagnosticano e classificano i tumori del sistema nervoso centrale (SNC) negli ultimi anni. La più recente classificazione dei tumori del SNC dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), pubblicata nel 2021, richiede ora di combinare l'esame microscopico tradizionale con i test molecolari per ottenere diagnosi accurate e riproducibili che influenzano direttamente l'assistenza al paziente.

Questo approccio integrato significa che i patologi devono ora lavorare con molteplici test molecolari, principalmente includendo la profilazione della metilazione del DNA e il sequenziamento di nuova generazione del DNA/RNA. Queste tecniche avanzate aiutano a classificare i tumori più precisamente, identificano specifiche mutazioni genetiche e rivelano persino potenziali bersagli terapeutici che non erano precedentemente rilevabili con i soli metodi convenzionali.

L'importanza della caratterizzazione molecolare si è ampliata notevolmente, con tutti i principali tipi di tumori del SNC che ora richiedono la valutazione di specifici marcatori molecolari per una corretta diagnosi. Molti nuovi tipi di tumore sono stati effettivamente scoperti attraverso queste tecnologie, in particolare l'analisi della metilazione del DNA, evidenziando quanto siano diventate essenziali nella neuropatologia moderna.

Principali test molecolari per la diagnosi e il trattamento dei tumori cerebrali

La neuropatologia molecolare include ora un'ampia gamma di test con scopi diversi, livelli di complessità, disponibilità e costi. Comprendere queste differenze è cruciale perché aiuta i medici a scegliere il test più appropriato per ogni specifica sfida diagnostica e a interpretare correttamente i risultati.

L'attuale cassetta degli attrezzi molecolari include diverse tecnologie essenziali che forniscono informazioni complementari sui tumori cerebrali. Ogni test ha specifici punti di forza e applicazioni che lo rendono particolarmente prezioso per determinate situazioni diagnostiche o tipi di tumore.

Profilazione della metilazione del DNA: uno strumento diagnostico rivoluzionario

La profilazione della metilazione del DNA è stata probabilmente lo strumento molecolare più impattante degli ultimi anni per la diagnosi dei tumori cerebrali. Questo approccio utilizza il profilo epigenetico unico delle cellule tumorali, che riflette sia le caratteristiche del loro tessuto originale sia i cambiamenti acquisiti durante lo sviluppo del cancro, creando una firma specifica per ogni tipo di tumore.

Praticamente, il profilo di metilazione del DNA viene attualmente valutato utilizzando il sistema a microarray MethylationEPIC beadchip (850K), che investiga lo stato di metilazione di diverse centinaia di migliaia di isole CpG in tutto il genoma. I dati grezzi vengono poi caricati su una piattaforma dedicata e confrontati con un repository completo di tumori del SNC e altre entità selezionate.

Un punteggio di corrispondenza ≥ 0,9 supporta fortemente la classificazione diagnostica, sebbene gli esperti rivedano sempre questi risultati insieme ai reperti clinici, di imaging e istopatologici. È importante notare che la profilazione della metilazione del DNA utilizzando questa piattaforma non è un test certificato, quindi diversi paesi possono avere normative variabili sul suo uso diagnostico.

Questa tecnologia si è dimostrata estremamente preziosa sia per la ricerca che per le finalità diagnostiche quotidiane. Per la ricerca, molti nuovi tipi e sottotipi di tumore sono stati scoperti attraverso l'analisi non supervisionata di ampi set di dati sui tumori cerebrali. Molti tumori di nuova identificazione mostrano significative sovrapposizioni con altre entità in termini di caratteristiche morfologiche e/o hanno un'incidenza molto bassa, spiegando perché non erano stati precedentemente riconosciuti come neoplasie distinte.

Nella pratica clinica, numerosi gruppi hanno pubblicato la loro esperienza con questa tecnologia sia in ambito pediatrico che adulto. In generale, un punteggio di corrispondenza (≥ 0,9) viene raggiunto in circa il 50-65% dei campioni, e un impatto significativo sulla diagnosi si verifica in circa il 10-20% dei casi con potenziali conseguenze cliniche. Questo risultato notevole giustifica la rapida adozione di questo strumento in pochi anni.

Punteggi mediani di classificazione più elevati si osservano solitamente nei casi analizzati per confermare una diagnosi o valutare specifici sottotipi tumorali. Una gamma più ampia di punteggi appare tra i campioni complessi o i campioni più piccoli. Punteggi più bassi nei casi complessi possono derivare da molteplici fattori, inclusi biopsie piccole, di scarsa qualità o non rappresentative che potrebbero essere non classificabili sia con la patologia tradizionale che con la profilazione della metilazione.

Idealmente, sono desiderabili 200 nanogrammi di DNA con una concentrazione di cellule tumorali ≥ 60%, sebbene la classificazione diagnostica possa essere raggiunta con quantità significativamente inferiori. I blocchi di tessuto in paraffina fissati in formalina (FFPE) tipicamente forniscono risultati simili ai campioni congelati freschi, e l'analisi di campioni più vecchi può anche produrre una classificazione corretta.

La profilazione della metilazione del DNA ha mostrato una particolare utilità per riclassificare tipi di tumore rari con caratteristiche istopatologiche aspecifiche. Sebbene ora sia uno strumento chiave per diagnosticare i tumori del SNC, questo approccio pone sfide significative in termini di strutture tecnologiche richieste, costi, tempi di risposta (più giorni) e competenze necessarie per l'esecuzione e l'interpretazione.

Sequenziamento del DNA e dell'RNA: rilevamento di mutazioni critiche

Molti tumori del SNC presentano specifiche mutazioni puntiformi rilevabili mediante sequenziamento del DNA o fusioni geniche identificate principalmente attraverso il sequenziamento dell'RNA. Ad esempio, le mutazioni nei geni IDH1/IDH2 e nei geni che codificano per H3 caratterizzano rispettivamente specifici sottogruppi di gliomi dell'adulto e pediatrici. Altre mutazioni, come BRAF V600E, possono apparire in multiple tipologie tumorali con frequenze variabili ma contribuiscono comunque alla valutazione diagnostica e consentono trattamenti mirati.

Multiple tipologie di test possono essere utilizzate per il sequenziamento del DNA, incluso il sequenziamento diretto di singoli geni (sequenziamento Sanger) e approcci basati sul sequenziamento di nuova generazione (NGS) come il sequenziamento di pannelli mirati e il sequenziamento dell'intero esoma/genoma (WES/WGS). Queste analisi rilevano variazioni di singoli nucleotidi (SNV), piccole inserzioni/delezioni (InDel) e variazioni del numero di copie (CNV).

Tra i test NGS, il sequenziamento di pannelli genici mirati è attualmente lo strumento più rilevante per il lavoro diagnostico molecolare quotidiano dei tumori del SNC. Consente l'analisi di set relativamente ampi di geni rilevanti con costi, tempi di risposta e fattibilità di interpretazione accettabili. Molti geni più rilevanti per la diagnosi dei tumori cerebrali sono relativamente specifici per queste neoplasie, giustificando pannelli personalizzati o più ampi.

L'efficacia diagnostica di pannelli genici di media dimensione è stata dimostrata, rilevando mutazioni e CNV anche con materiale di input limitato. Studi più recenti utilizzando pannelli genici più ampi (inclusi IDH1/IDH2, TERT, TP53, ATRX, BRAF, H3F3A, H3F3B) hanno confermato questi risultati. Questi test rilevano alterazioni diagnostiche rilevanti in più della metà dei tumori del SNC analizzati, con CNV informativi rilevati nel 57% dei casi anche quando i risultati NGS erano non contributivi.

I protocolli di laboratorio sono critici per il successo del sequenziamento. La qualità del DNA e la percentuale di cellule tumorali dovrebbero essere massimizzate, con un'adeguata copertura/profondità di lettura raggiunta in base al tipo di test e alle caratteristiche del campione. La pipeline di analisi dei dati e l'esperienza del patologo molecolare che redige il referto sono ugualmente importanti per la corretta chiamata e interpretazione delle varianti.

L'analisi del DNA tumorale circolante (ctDNA) dal sangue e/o dal liquido cerebrospinale rappresenta un altro approccio alla caratterizzazione molecolare del tumore attraverso la biopsia liquida minimamente invasiva. Le sfide tecniche hanno finora limitato l'implementazione nella pratica quotidiana, ma dati recenti mostrano che pannelli NGS completi possono rilevare CNV e affrontare l'eterogeneità intratumorale anche nel ctDNA.

Per il sequenziamento dell'RNA, lo scopo diagnostico principale è rilevare fusioni geniche, che caratterizzano molti tumori del SNC. Ad esempio, gli astrocitomi pilocitici ospitano frequentemente la fusione KIAA1549::BRAF, e specifici sottotipi molecolari di ependimoma sopratentoriale sono definiti da fusioni ZFTA o YAP1. Le fusioni geniche possono rappresentare bersagli terapeutici sfruttabili, come visto nei gliomi emisferici di tipo infantile frequentemente caratterizzati da fusioni geniche NTRK1/NTRK2/NTRK3, ROS1, ALK o MET con inibitori efficaci disponibili.

Studi focalizzati sul significato dell'RNA NGS nei tumori del SNC mostrano che questo strumento è particolarmente prezioso per le neoplasie pediatriche, che presentano più frequentemente questi eventi. Nelle neoplasie cerebrali dell'adulto, le fusioni geniche sono relativamente rare e di solito non rappresentano bersagli terapeutici.

Ulteriori strumenti e tecniche diagnostiche

La valutazione mediante microarray delle variazioni del numero di copie dell'intero genoma (CNV) è un altro strumento diagnostico rilevante frequentemente utilizzato per caratterizzare molecolarmente i tumori del SNC, specialmente prima che la profilazione della metilazione del DNA diventasse disponibile. Questi test rilevano molte alterazioni cromosomiche (delezioni, amplificazioni, perdita di eterozigosità, perdita di eterozigosità copy-neutral, cromotripsi) che servono come marcatori diagnostici e/o prognostici di specifici tipi tumorali.

La caratterizzazione molecolare non significa necessariamente l'analisi simultanea di multiple alterazioni. L'ibridazione in situ a fluorescenza (FISH) può valutare specifici loci di DNA direttamente su vetrini tissutali, utile per scopi di validazione o quando un'alterazione specifica è fortemente sospettata in base alle caratteristiche del tumore o quando il materiale è insufficiente per altre analisi.

Invece degli acidi nucleici, le proteine possono essere valutate utilizzando colorazioni immunoistochimiche ampiamente disponibili, rapide ed economiche. L'immunoistochimica può stabilire la presenza di proteine mutate (IDH1 R132H, p53, H3 K27M, H3 G34R/V, BRAF V600E), la perdita di proteine normali/funzionanti (ATRX, H3 K27me3, INI1, BRG1) o l'iperattivazione di vie aberranti (EZHIP).

La valutazione della metilazione del promotore MGMT rimane cruciale per la caratterizzazione molecolare del glioblastoma IDH-wildtype a causa della sua rilevanza prognostica e predittiva. Multiple test possono investigare questo marcatore, senza una chiara superiorità nelle correlazioni cliniche. Poiché non esistono criteri di equivalenza tra diversi test, è importante comprendere le caratteristiche del test disponibile localmente. L'immunoistochimica per MGMT non è un surrogato affidabile per questi test.

Applicazione dei test molecolari alla diagnosi dei tumori cerebrali

Le analisi molecolari contribuiscono o sono richieste per diagnosticare molti tipi di tumore riconosciuti dalla classificazione OMS 2021. Gli strumenti molecolari più rilevanti variano in base alla specifica neoplasia, con esempi selezionati che dimostrano l'importanza di questi strumenti nella pratica neuropatologica attuale.

Glioma diffuso dell'adulto: come i test molecolari guidano la diagnosi

Secondo la classificazione WHO del 2021, i gliomi diffusi dell'adulto sono stratificati principalmente in base allo stato di IDH1/IDH2. Questa suddivisione è ben giustificata dalle diverse biologie tumorali, meccanismi oncogenici e implicazioni cliniche associate a questo marcatore molecolare.

Il glioblastoma IDH-wildtype è il glioma diffuso più frequente, che solitamente si manifesta in adulti anziani con prognosi infausta. Si tratta di una neoplasia morfologicamente e molecularmente eterogenea che tipicamente mostra caratteristiche astrocitiche scarsamente differenziate con crescita infiltrativa, elevata proliferazione, proliferazione microvascolare e necrosi. In presenza di morfologia coerente, i medici devono escludere la mutazione di IDH1/IDH2 per escludere l'astrocitoma IDH-mutato o l'oligodendroglioma IDH-mutato con codelezione 1p/19q.

Esistono multiple opzioni per questo compito: l'immunoistochimica per IDH1 R132H può escludere la mutazione più frequente (circa il 90% dei gliomi sopratentoriali IDH-mutati). Questa strategia funziona adeguatamente per pazienti di età pari o superiore a 55 anni, dove la probabilità di trovare una mutazione alternativa è inferiore all'1%. Tuttavia, se l'anamnesi suggerisce un precedente glioma di basso grado, è necessaria la sequenziazione.

Se mancano i caratteri morfologici del glioblastoma ma è sospettato, la classificazione WHO 2021 consente la diagnosi molecolare di glioblastoma. Ciò richiede un profilo di metilazione del DNA coerente o almeno uno dei tre marcatori: guadagno del cromosoma 7 più perdita del cromosoma 10, mutazione del promotore TERT o amplificazione di EGFR. Questi marcatori mostrano specificità relativa nel contesto appropriato, con esiti simili ai pazienti diagnosticati mediante caratteri morfologici.

Per i gliomi diffusi IDH-mutati, la diagnosi richiede reperti istopatologici coerenti con un glioma diffuso infiltrante con mutazione di IDH1/IDH2 e perdita/mutazione di ATRX o esclusione della codelezione 1p/19q. L'oligodendroglioma IDH-mutato e codeletto 1p/19q richiede la codelezione combinata dei bracci interi 1p/19. In alternativa, la diagnosi può basarsi sul rilevamento della corrispondente classe di metilazione.

Lo stato di ATRX può essere valutato con immunoistochimica (attenzione agli artefatti da necrosi o astrociti reattivi non neoplastici positivi intermisti) o sequenziazione per rilevare mutazioni di perdita di funzione. La valutazione di TP53/p53 è utile poiché frequentemente presente negli astrocitomi IDH-mutati.

Per diagnosticare tumori IDH-mutati e codeletti 1p/19q, il segno distintivo critico è la codelezione dei bracci interi 1p/19q, investigabile con multiple metodiche tra cui FISH. Tuttavia, il targeting limitato di FISH a singoli loci può produrre falsi positivi, specialmente in tumori con cariotipi complessi. Valutazioni FISH falsamente positive si verificano frequentemente in casi dove la valutazione dello stato 1p/19q non sarebbe stata giustificata, sottolineando l'importanza di un uso appropriato del test.

Per la stadiazione dei gliomi diffusi IDH-mutati, i caratteri morfologici rimangono critici, ma la classificazione WHO 2021 ha aggiunto la valutazione dello stato di CDKN2A/B come criterio di grading per gli astrocitomi IDH-mutati. Con delezione omozigote di CDKN2A/B, viene assegnato il grado 4 per l'associazione con esito sfavorevole. Lo stato di CDKN2A/B può essere valutato mediante profili di metilazione del DNA con plot CNV, NGS del DNA o FISH, sebbene non sia stato stabilito un valore di cut-off conclusivo.

Cosa Significa per i Pazienti: Implicazioni Cliniche

L'integrazione dei test molecolari nella diagnosi dei tumori cerebrali rappresenta un cambiamento fondamentale nell'assistenza al paziente. Queste tecniche avanzate forniscono diagnosi più accurate, migliori informazioni prognostiche e identificano potenziali bersagli terapeutici precedentemente non rilevabili.

Per i pazienti, ciò significa approcci terapeutici più personalizzati basati sulle specifiche caratteristiche genetiche del loro tumore. La profilazione molecolare può identificare terapie mirate che possono essere più efficaci dei trattamenti convenzionali, specialmente per tumori con mutazioni specifiche come BRAF V600E o fusioni geniche che coinvolgono i geni NTRK, ROS1, ALK o MET.

La capacità di classificare i tumori più precisamente migliora anche l'accuratezza prognostica, aiutando pazienti e medici a prendere decisioni più informate sull'intensità del trattamento e l'assistenza di follow-up. Ad esempio, la distinzione tra gliomi IDH-mutati e IDH-wildtype influisce significativamente sugli esiti attesi e sugli approcci terapeutici.

I test molecolari consentono anche l'identificazione di pazienti che potrebbero beneficiare di studi clinici su nuove terapie mirate, ampliando le opzioni terapeutiche oltre gli approcci standard. Ciò è particolarmente importante per tipi tumorali aggressivi o rari dove i trattamenti convenzionali offrono benefici limitati.

Comprendere i Limiti dei Test Molecolari

Sebbene i test molecolari abbiano rivoluzionato la diagnosi dei tumori cerebrali, è importante comprenderne i limiti. Queste tecnologie richiedono significativa competenza per essere interpretate correttamente, e i risultati devono sempre essere considerati insieme a reperti clinici, di imaging e patologici tradizionali.

Le sfide tecniche includono la necessità di materiale tumorale sufficiente e di adeguata qualità. Biopsie piccole, scarsa conservazione o basso contenuto di cellule tumorali possono limitare l'efficacia dei test molecolari. Alcuni test hanno anche tempi di refertazione relativamente lunghi (più giorni) rispetto all'esame patologico tradizionale.

Costo e disponibilità rimangono barriere significative per l'implementazione universale della profilazione molecolare completa. Non tutti i centri medici hanno accesso a queste tecnologie avanzate, specialmente in contesti con risorse limitate.

Sebbene la classificazione molecolare fornisca informazioni preziose, non sempre si traduce direttamente in decisioni terapeutiche. Alcune alterazioni molecolari non hanno ancora corrispondenti terapie mirate, e il significato clinico di cambiamenti genetici di recente scoperta potrebbe non essere completamente compreso.

Risultati falsi positivi e falsi negativi possono verificarsi con qualsiasi test, sottolineando l'importanza dell'interpretazione esperta e della correlazione con altre informazioni diagnostiche. Ciò è particolarmente rilevante per test come FISH, dove limitazioni tecniche possono talvolta produrre risultati fuorvianti.

Raccomandazioni per Pazienti Affrontando la Diagnosi di Tumore Cerebrale

Per pazienti diagnosticati o sospettati di avere un tumore cerebrale, diverse raccomandazioni possono aiutare a navigare il processo diagnostico:

1. Cercare test molecolari completi: Chiedi al tuo team medico le opzioni disponibili di profilazione molecolare, inclusi la profilazione della metilazione del DNA e pannelli di sequenziazione mirata, poiché possono fornire informazioni diagnostiche e prognostiche critiche.
2. Comprendere le caratteristiche specifiche del tuo tumore: Richiedi spiegazioni chiare di qualsiasi reperto molecolare e di come influisce sulla tua diagnosi, prognosi e opzioni terapeutiche.
3. Considerare seconde opinioni: L'interpretazione dei test molecolari richiede significativa competenza. Cercare una revisione del tuo caso in un centro specializzato di neuro-oncologia può garantire la diagnosi più accurata.
4. Discutere opzioni di studi clinici: Se il tuo tumore ha caratteristiche molecolari specifiche, chiedi informazioni su studi clinici di terapie mirate che potrebbero essere appropriate per la tua situazione.
5. Preservare il tessuto tumorale: Se sottoposto a intervento chirurgico, discuti con il team chirurgico l'importanza di preservare adeguato materiale tumorale per potenziali test molecolari, sia inizialmente che per future rivalutazioni se necessario.
6. Considerare consulenza genetica: Alcuni reperti molecolari possono suggerire una predisposizione ereditaria al cancro. Discuti con il tuo medico se la consulenza genetica potrebbe essere appropriata.

Ricorda che i test molecolari sono più preziosi quando integrati con altre informazioni cliniche. Collabora con il tuo team medico per comprendere come queste diagnostiche avanzate si inseriscono nel tuo piano terapeutico complessivo e cosa significano per la tua situazione specifica.

Informazioni sulla Fonte

Titolo Originale dell'Articolo: Molecular neuropathology: an essential and evolving toolbox for the diagnosis and clinical management of central nervous system tumors

Autori: Luca Bertero, Luca Mangherini, Alessia Andrea Ricci, Paola Cassoni, Felix Sahm

Pubblicazione: Virchows Archiv (2024) 484:181–194

DOI: https://doi.org/10.1007/s00428-023-03632-4

Questo articolo a misura di paziente si basa su ricerca peer-reviewed e mira a rendere accessibili informazioni scientifiche complesse a pazienti e caregiver preservando tutte le informazioni mediche essenziali dello studio originale.